一、寡核苷酸药物简介
一些先天性遗传病、病毒类传染病，如遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性、杜氏肌萎缩症、乙型肝炎等，目前仍无疗效较好的药物，寡核苷酸类药物因其与传统药物作用机制不同有望填补一些传统药物的空白治疗领域。寡核苷酸药物一般由12～30个左右核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸单链或双链组成，通过Watson-Crick 碱基配对原则作用于目标信使RNA(mRNA)，通过基因沉默、剪接调节、非编码RNA抑制、基因激活、基因编辑等等一系列机制来调节基因表达；另外还有一类核酸适配子，与抗体类药物作用机制相似能与靶分子结合，具有高特异性和高亲和力，大多数核酸适配子与靶分子结合后对靶分子有抑制作用，可广泛用于抗凝血、抗病毒、抗增殖、抗炎等治疗领域。
过去由于寡核苷酸药物缺乏有效的递送系统，并且容易产生脱靶效应和免疫反应，在临床应用中并不成功。近年来，特殊递药系统的出现以及化学修饰技术的发展可以在很大程度上改善上述问题。寡核苷酸药物能实现基因层面治本效果，成为继重组蛋白药物、抗体药物之后的新一轮药物研发热点。截止2020年1月，全球范围内已经有10款寡核苷酸药物获得美国FDA批准上市，同时还有50多个在研寡核苷酸药物处于不同临床研究阶段。
本文主要对已报道的寡核苷酸药物及其采用的生物分析方法进行梳理。
二、寡核苷酸药物的生物分析方法
目前已报道的寡核苷酸生物分析方法较为多样，如 ECL、LC-FL、杂交ELISA、LC-MS/MS、RT-qPCR，基本需要经过较为复杂的前处理，如SPE纯化、PCR扩增、探针杂交等。
寡核苷酸固有的多阴离子性质使其生物分析测定的灵敏度在很大程度上取决于寡核苷酸分子的长度和化学修饰。一般来说，增加寡核苷酸长度/大小会引起LC-MS/MS 或LC-HRMS的检测灵敏度降低，但会增加基于杂交的分析法( 如qPCR、LC-FL) 的灵敏度。就寡核苷酸的绝对定量生物分析而言，qPCR和LC-FL 分析法的灵敏度更高，而LC-MS/MS 和LC-HRAM 分析的特异性更好。目前，LC-MS 通常更适用于含有13个或更少核苷酸单元的寡核苷酸的定量分析，而基于杂交的LC-FL分析更适用于含有24个或更多核苷酸单元的寡核苷酸的定量分析。
此外，还需要考虑每个寡核苷酸药物代谢物的个体差异。一般来说，经化学修饰的寡核苷酸的碱基组成对杂交分析的影响比色谱分析更为显著。因此，RT-qPCR主要用于未经修饰的寡核苷酸的定量；对于修饰后的寡聚核苷酸药物，如果灵敏度满足分析需要，则首选LC-MS分析方法，但如果需分析鉴定及定量未知代谢物的浓度则选择Q-Exactive系列的LC-HRMS。如果灵敏度和特异性都很重要且在LC可以充分分离寡核苷酸与其主要代谢物条件下，则选择LC-FL。但是，LC-FL分析法需要设计特殊的引物或探针、单个药品分析时间长不利于大批量样本分析，不能特异性测量寡核苷酸代谢物，而LC-MS和LC-HRMS分析法不需要特殊的引物或探针且能够在一次分析中同时定量和监测多个寡核苷酸（和代谢物）。再者，LC-MS和LC-HRMS分析法特异性好、精密度和准确度高、重现性好、线性范围宽、高通量、可进行靶向或全扫描。可以同时定量和监测多个寡核苷酸（包括代谢物）。所以，用于受监管的寡核苷酸药物和生物标志物的生物分析时，建议选择LC-MS，而早期的药物开发及PK/TK 研究建议选择LC-HRMS。
三、寡核苷酸药物的生物分析案例
1.Defibrotide（去纤苷钠）
图1. Defibrotide结构图
Defibrotide由Gentium研发，2013年10月18日获得欧洲EMA批准，2016年3月30日获得美国FDA批准上市，商品名为Defitelio。Defibrotide是一种具有纤溶酶特性的寡核苷酸混合物，对腺苷受体A1和A2具有亲和力，能提高纤溶酶水解纤维蛋白凝块的酶活性，增加组织纤溶酶原激活物t-PA和血栓调节蛋白表达，减少血管性血友病因子vWF和纤溶酶原激活物抑制剂PAI-1表达。该药被批准用于治疗肝小静脉闭塞症伴随造血干细胞移植后肾或肺功能障碍。
生物分析方法：HPLC（UV）[1]
高效液相色谱Waters 2690 system，UV 检测器Waters 2487，C8 Column (3.5 μm, 2.1 × 100 mm, Waters X Bridge) ，柱温50°C通过检测260 nm波长的紫外吸收定量。流动相：25 mmoL/L 乙酸铵溶液 (pH 9.0, 流动相A)， 50 mmoL/L乙酸铵溶液(pH 9.0)/乙腈/甲醇 (50/45/5，v/v/v, 流动相 B)， 1% 氨水 (流动相C)，含0.1%甲酸的乙腈/超纯水(9/1，v/v, 流动相D)。流速0.4 ~ 0.5 mL/min，进样体积20 μL。
2.Golodirsen（Vyondys 53）
图2. Golodirsen结构图
Golodirsen由Sarepta Therapeutics研发，于2019年12月12日获FDA批准上市，用于治疗杜氏肌营养不良症（DMD）。是一种二氨基磷酸酯吗啉代寡聚体（PMO）亚类的反义寡核苷酸，可以靶向结合抗肌萎缩蛋白前体mRNA，使该前体mRNA剪切过程中的外显子53跳跃，产生截短但仍具有功能的抗肌萎缩蛋白dystrophin。
生物分析方法：通过SPE纯化后采用LC-MS/MS方法进行检测。[2]
1. Pegaptanib (Macugen)
Pegaptanib是由Eyetech和Pfizer研发的聚乙二醇化的修饰性寡核苷酸，最早于2004年在美国获批上市，也是目前唯一获批的核酸适配子。Pegaptanib 是VEGF异构体165 (VEGF165)的拮抗剂，为一种化学合成的寡核苷酸序列，对血管内皮生长因子VEGF具有高度的亲和力。它能阻止血管生长，抑制新生血管形成，对任何大小和组成的CNV均有治疗作用，其钠盐用于治疗新生血管性年龄相关性黄斑病变。
图3. Pegaptanib结构图
检测方法：采用双杂交方法（dual hybridization）进行检测，定量下限为0.5 ng/mL。[3]方法作用机制：捕获探针（Capture Probe）、检测探针（Detection Probe）和待测物（Target Aptamer）上、下游片断分别结合。在DNA连接酶的作用下，将捕获探针和检测探针连接为一条完整的DNA单链。设计2个Taqman探针，实时荧光定量PCR法同时定量和目标待测物互补的捕获探针端以及远离目标待测物的检测探针端。
图4. Pegaptanib检测原理一
图5. Pegaptanib检测原理二
4. Nusinersen（诺西那生钠）
图6. Nusinersen结构图
诺西那生钠注射液是由渤健公司（Biogen Idec Ltd）研发的脊髓性肌肉萎缩症治疗药物，于2016年12月23日首次在美国获批，用于治疗脊髓性肌萎缩症(SMA)。SMA是一种隐性遗传性神经肌肉疾病，由存活运动神经元1(SMN1)的突变或缺失引起，该基因位于5号染色体上。
Nusinersen是一种均匀修饰的反义寡核苷酸，长度为18个核苷酸，被设计成与SMN2第7内含子中的一个序列结合，可以改变SMN2前mRNA的剪接，从而增加完整长度SMN蛋白的产生。
生物分析方法： ELISA和ECL平台，灵敏度分别为1.5 ng/mL和0.05 ng/mL，定量范围分别为1.5 ng/mL ~ 150 ng/mL、0.05000 ng/mL ~ 10.00 ng/mL。[4,5]
ECL法基于MSD平台完成开发，方法原理主要有3种类型：T4连接酶法、OLA法和RNase保护法。
图7. T4连接酶法原理
| 基本原理：设计和寡核苷酸5’端和3’端互补的探针序列，和5’端互补的探针同时含有一段额外的序列，和3’端互补的探针序列同时标记Biotin，2个探针和T4 DNA连接酶一起加入待测样品共同孵育，在连接酶的作用下将上下游引物连接起来，加入预包被和上游探针额外序列互补的核苷酸片段的MSD板中，孵育后加入Streptavidin SULFO-TAG和Read Buffer检测信号。 |
图8. OLA法原理
| 基本原理：原理基本和T4连接酶介导的寡核苷酸检测相同，不同之处仅在于将T4连接酶替换为Taq DNA连接酶，因Taq DNA连接酶为热稳定的DNA连接酶，可通过变性-退火-延伸进行片段扩增，循环数可达30，大大提高检测的灵敏度。本方法需要结合PCR仪进行预处理对目标片段扩增。 |
图9. RNase保护法原理
| 基本原理：设计RNA片段，其5’端和预包被到MSD板的核苷酸序列互补、3’端和待测寡核苷酸互补同时标记Biotin，加入待测样品中孵育，RNA片段和待测寡核苷酸结合后加入预包被捕获核苷酸的MSD板被捕获，洗板后加入RNase I将未和寡核苷酸结合的RNA降解，再通过加入Read Buffer检测信号。 |
5. Patisiran（ONPATTRO）
Patisiran由专注于RNAi疗法开发领域的领军企业Alnylam制药公司研发，2018年8月由美国FDA批准上市，用于遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性多发性神经病（hATTR）成人患者第1阶段或第2阶段多发性神经病的治疗。Patisiran是全球第一个RNAi生物技术药物，使用阳离子脂质体作为载药系统，实现核酸聚合物的有效聚集和递送，静脉输注后药物直接递送至肝脏细胞内，沉默hATTR mRNA的表达，减少产生hTTR蛋白，逐渐减少周围神经中淀粉样沉积物(hTTR)的积累，最终达到治疗疾病的目的。
图10. Patisiran结构图
生物分析方法：ATTO荧光探针结合HPLC（荧光检测器）对RNA进行定量，定量下限为1 ng/mL。[6,7] 采用LC-MS/MS方法对参与脂质体构建的2种新分子PEG2000-C-DMG、DLin-MC3-DMA进行定量。
6. Alicaforsen（ISIS 2302）
ISIS2302 由Ionis制药公司(Ionis Pharmaceuticals Inc)研发,是一种具有反义活性的硫代寡核苷酸，靶向细胞间粘附分子-1 mRNA，被提议用于治疗各种炎症性疾病包括器官移植排斥反应、炎症性肠病、关节炎和牛皮癣。
目前报道的生物分析方法为非竞争性杂交ELISA法，基于模板（同时含有待测物反义寡核苷酸和结合探针的互补序列）、待测物反义寡核苷酸以及结合探针（信号探针）的结合。同时结合模板的待测反义寡核苷酸和结合探针在DNA连接酶的作用下合成为一条链，因为亲和力存在差异，通过洗涤可以去除未与待测核苷酸形成单链的结合探针。模板在3’端含有生物素，和板底结合，结合探针5’端含有地高辛，通过加入偶连碱性磷酸酶的抗地高辛抗体及相应的底物生成荧光物质AttoPhos被检测。
图11. 杂交ELISA法检测流程
关于鼎泰
金沙6165总站线路检测(中国)有限公司生物分析中心于2020年5月完成国内首个新冠mRNA疫苗的临床前安全性评价，评价内容包括食蟹猴肌肉注射重复给药四周期和单次给药急性毒性试验，试验过程中采用Q-PCR方法进行十四种组织和全血中的mRNA检测并完成遵循GLP规范的全套方法学验证，方法灵敏度达到50 copies/10ng total RNA，验证项目包括标准曲线和定量范围，选择性，灵敏度，特异性，准确度与精密度，稀释线性，胡克效应，平行性，各处理条件下的组织和全血稳定性以及提取后RNA存储条件下的稳定性，均可满足预设的接受标准。目前生物分析中心具备多台Molecular Devices酶标仪（SpectraMax M3、SpectraMax M5、SpectraMax L）、2台MSD（Quickplex SQ120）、2台QPCR仪（QuantStudio 7 Flex）、5台LC-MS/MS（AB Sciex5500），多位具备5年以上从业经验的技术团队，可以胜任不同类型寡核苷酸药物的生物分析。
参考文献：
[1] Kazuo Umemura,Takayuki Iwaki, Toshimi Kimura, et al. Pharmacokinetics and Safety of Defibrotide in Healthy Japanese Subjects. Clinical Pharmacology in Drug Development. 2016, 00(0) 1–4
[2] CLINICAL PHARMACOLOGY REVIEW(S), APPLICATION NUMBER: 211970Orig1s000, CENTER FOR DRUG EVALUATION AND RESEARCH
[3] Anthony SBasile, Matthew M Hutmacher, Kenneth GKowalski, et al.
Population pharmacokinetics of pegaptanib sodium (Macugen®) in patients with diabetic macular edema. Clinical Ophthalmology. 2015:9 323–335
[4] Claudia A. Chiriboga, Kathryn J. Swoboda, Basil T. Darras, et al. Results from a phase 1 study of nusinersen (ISIS-SMNRx) in children with spinal muscular atrophy. American Academy of Neurology. 2016;86:1–8
[5]Kenneth T. Luu, , Daniel A. Norris, , Rudy Gunawan, et al. Population Pharmacokinetics of Nusinersen in the Cerebral Spinal Fluid and Plasma of Pediatric PatientsWith Spinal Muscular Atrophy Following Intrathecal Administrations. The Journal of Clinical Pharmacology 2017, 00(0) 1–11
[6] Xiaoping Zhang, Varun Goel, Husain Attarwala, et al. Patisiran Pharmacokinetics,
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[7] Xiaoping Zhang,Varun Goel, and Gabriel J. Robbie. Pharmacokinetics of Patisiran, the First Approved RNA Interference Therapy in Patients With Hereditary
Transthyretin-Mediated Amyloidosis. The Journal of Clinical Pharmacology
2020, 60(5) 573–585
[8] Rosie Z. Yu,Brenda Baker, Alfred Chappell, et al. Development of an Ultrasensitive Noncompetitive Hybridization–Ligation Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for the Determination of Phosphorothioate Oligodeoxynucleotide in Plasma. Analytical Biochemistry 304, 19–25 (2002)
[9] Thomas C. Roberts, Nature Reviews, https://doi.org/10.1038/s41573-020-0075-7（Golodirsen、Patisiran、Macugen结构图来源）
[10] Use of the N-PLEXTM Platform for the Detection of Antisense oligonucleotides(ASOs) in Plasma, MSD
[11] DETECTION OF OLIGONUCLEOTIDES BY DUAL HYBRIDIZATION，United States Patent, No.:US7785784B2